輔酶ⅠNAD（H）含量測定試劑盒說明書 |
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輔酶ⅠNAD(H)含量測定試劑盒說明書 微量法 正式測定前務必取 2-3個預期差異較大的樣本做預測定 測定意義 輔酶 NAD(H)Ⅰ廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環（TCA）的主要氫受體，生成的 NADH 經呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成 ATP 的同時，形成大量的 ROS，同時 NADH 再生為 NAD+。糖、脂、蛋白質三大代謝物質分解中的氧化反應絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于評價糖酵解和TCA循環的強弱。較高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值說明細胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環。另外，NAD+降解產物對細胞信號傳導、代謝和基因表達等具有重要的調控作用。 測定原理 分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍（MTT）為甲瓚，在570nm下檢測吸光值；而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用MTT還原法檢測。 需自備的儀器和用品 可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。 試劑的組成和配制 酸性提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存； 堿性提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 10 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 3 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑三：粉劑×1 瓶，-20 ℃保存，用時加入3mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周； 試劑四：粉劑×1 瓶，4 ℃保存，用時加入3mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周； 試劑五：液體 3.6mL×1 瓶，4 ℃保存； 試劑六：液體 30mL×1 瓶，4 ℃保存； 試劑七：液體 50mL×1 瓶，4 ℃保存。 NAD+和NADH的提取 1 血清（漿）中 NAD+和NADH的提取 NAD+的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）； 冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 NADH 的提取：按照血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建 議取約0.1mL 血清（漿），加入 1mL 堿性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 2 組織中 NAD+和NADH 的提取： NAD+的提取：按照組織質量（g）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 NADH 的提取：按照組織質量（g）：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g組織，加入 1mL 堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 3 細胞或細菌中NAD+和NADH的提取： NAD+的提取：先收集細胞或細菌到離心管內，棄上清，按照細菌或細胞數量（104個）：酸性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL酸性提取液），超聲波破碎 1min（冰浴，強度20％或200W，超聲2s，停1s），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 NADH 的提取：先收集細胞或細菌到離心管內，棄上清，按照細菌或細胞數量（104個）：堿性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL堿性提取液），超聲波破碎 1min（冰浴，強度 20％或 200W，超聲2s，停1s），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 測定步驟： 1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至570nm，蒸餾水調零。 2、加樣表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加樣）：
混勻，取200μL轉移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm下讀取對照吸光值A1和測定管吸光值 A2，計算△A=A2-A1。 注意事項 1、如果一次性測定樣本數較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。 2、對照管和測定管的測定步驟的區別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應 20min 后再加試劑六。 3、反應過程中注意避光。 4、由于每一個測定管需要設一個對照管，本試劑盒100管保證測48個NAD+或 NADH. NAD+和NADH含量的計算 a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下 （一）NAD+含量的計算 1、血清（漿）中 NAD+含量計算 NAD+含量(nmol/mL）=[(△A -0.099）×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(△A -0.099） 2、組織、細菌或細胞中 NAD+含量計算 (1)按樣本蛋白濃度計算 NAD+(nmol/mg prot）=[(△A-0.099）×36.1×V1)]÷(V1×Cpr) =36.1×(△A-0.099）÷Cpr (2)按樣本鮮重計算 NAD+(nmol/g 鮮重）= [(△A-0.099）×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2) = 72.2×(△A -0.099）÷W (3)按細菌或細胞密度計算 NAD+(nmol/104cell）=[(△A -0.099）×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(△A -0.099） （二）NADH 含量的計算 1、血清（漿）中NADH含量計算 NADH 含量(nmol/mL）= [(△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(△A -0.065） 2、組織、細菌或細胞中 NADH 含量計算 (1)按樣本蛋白濃度計算 NADH (nmol/mg prot）= [(△A-0.065）×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr) = 24.7×(△A -0.065）÷Cpr (2)按樣本鮮重計算 NADH (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2) = 49.4×(△A -0.065）÷W (3)按細菌或細胞密度計算 NADH (nmol/104cell）= [(△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2) =0.0988×(△A -0.065） V1：加入反應體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬。 b.用96孔板測定的計算公式如下 （一）NAD+含量的計算 1、血清（漿）中 NAD+含量計算 NAD+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.099）×72.2×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 1444×(△A -0.099） 2、組織、細菌或細胞中 NAD+含量計算 (1)按樣本蛋白濃度計算 NAD+ (nmol/mg prot）=[(△A-0.099）×72.2×V1)]÷(V1×Cpr) = 72.2×(△A -0.099）÷Cpr (2)按樣本鮮重計算 NAD+ (nmol/g 鮮重）= [(△A-0.099）×72.2×V1)]÷(W×V1÷V2) = 144.4×(△A -0.099）÷W (3)按細菌或細胞密度計算 NAD+(nmol/104cell）=[(△A -0.099）×72.2×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.2888×(△A -0.099） （二）NADH 含量的計算 1、血清（漿）中 NADH 含量計算 NADH 含量(nmol/mL）= [(△A -0.065）×49.4×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 988×(△A -0.065） 2、組織、細菌或細胞中 NADH 含量計算 (1)按樣本蛋白濃度計算 NADH (nmol/mg prot）= [(△A-0.065）×49.4×V1) ]÷(V1×Cpr) = 49.4×(△A -0.065）÷Cpr (2)按樣本鮮重計算 NADH (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.065）×49.4×V1) ]÷(W×V1÷V2) = 98.8×(△A -0.065）÷W (3)按細菌或細胞密度計算 NADH (nmol/104cell）= [(△A-0.065）×49.4×V1) ]÷(500×V1÷V2) =0.1976×(△A -0.065） V1：加入反應體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬。 注意：低檢測限為 1nmol/mL 或 或 1nmol/g 鮮重 或 或 0.01nmol/mg prot
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