ATP含量試劑盒說明書 |
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ATP含量試劑盒說明書 微量法正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定 測定意義： ATP廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是生物能量通貨，能荷是描述細胞能量代謝狀態的主要參數。測定ATP含量并且計算能荷，能夠反映能量代謝狀態。 測定原理： 肌酸激酶催化肌酸和ATP反應生成磷酸肌酸，可在700nm下用磷鉬酸比色法檢測磷酸肌酸含量，以此反應ATP含量。 自備儀器和用品： 分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調式移液槍、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。 試劑組成和配制： 酸性提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存； 堿性提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：粉劑×1 支，4℃保存；臨用前加入 1mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃ 保存； 試劑二：液體 1.5mL×1 支，4℃保存； 試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 500μL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存一周； 試劑四：液體 5mL×1 瓶，4℃保存； 試劑五：液體 25mL×1 瓶，4℃保存； 標準液：液體 10mL×1 瓶，2μmol/mLATP 標準液，4℃保存； ATP 提取： 1、血清（漿）中ATP的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），進行冰浴勻漿，8000g 4℃離心 10min；取上清液至另一EP管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g4 ℃ 離心 10min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質含量測定）。 2、組織中 ATP 的提取：按照組織質量（g）：酸性提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），進行冰浴勻漿，8000g 4℃離心10min，取上清至另一EP管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質含量測定）。 3、細胞或細菌中ATP的提取：先收集細胞或細菌到離心管內，棄上清，按照細菌或細胞數量（104 個）：酸性提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL 酸性提取液），超聲波破碎1min（冰浴，強度20％或200W，超聲2s，停1s），8000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一EP管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g 4℃ 離心 10min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質含量測定）。
測定步驟： 1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長到700nm，蒸餾水調零。 2、顯色劑的配制：臨用前請根據擬用顯色劑體積（樣本數×0.2 mL），按試劑四(mL)：試劑五（mL）=1：5 的比例配制。用多少配多少。 3、樣本測定：
37℃水浴20min后，700nm下測定各管吸光值 注意 ：空白管和標準管通常只需要各做一個。每個測定管設一個對照管。 ATP 含量計算： 1、血清（漿）中ATP含量計算 ATP含量(μmol/mL)=[C標準管×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)×V1]÷(V3×V1÷ V2)=40×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管) 2、組織、細菌或細胞中ATP含量計算 （1） 按蛋白濃度計算 ATP含量(μmol/mg prot)=[C標準管×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)×V1]÷(V1÷ Cpr）=2×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)÷Cpr 蛋白質含量需要另外測定。 （2） 按樣本鮮重計算 ATP含量（μmol/g 鮮重)=[C標準管×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)×V1]÷(W×V1÷ V2)=4×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)÷W （3） 按細菌或細胞密度計算 ATP含量(μmol/104cell）=[C標準管×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)×V1]÷(500× V1÷V2)=0.008×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)÷W C 標準管：標準液濃度，2μmol/mL；V1：加入反應體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； W：樣本質量， g；500：細胞或細菌總數，500 萬。 注意：低檢測限為 10nmol/mL 或10nmol/g鮮重或 0.1nmol/mg prot
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